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技術文章
更新時間：2026-08-11
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很多普通人提到蛋白質，第一反應往往是日常補身體的“營養品"、健身人群用來增肌塑形的“增肌粉"，是一種幫助維持身體狀態、增長肌肉的營養補充物。
但在生物醫藥研發生產、體外診斷試劑開發、分子生物學實驗用工具酶制備這些專業應用場景里，蛋白質的角色和屬性不同，它更像一臺經過精準折疊組裝，依靠水分子作用力以及分子間各類弱相互作用來維持自身構型的精密儀器：
• 它必須依靠自身形成的特定三維空間結構，才能夠精準完成催化生化反應、特異性結合靶點、識別目標分子這些核心生物學功能，一旦結構改變，功能也會隨之喪失；
• 它的空間結構并不是像金屬構件那樣被固定、焊死不能變動的，而是始終處在“整體可動、構象呼吸、局部微振動"的動態平衡狀態中，維持著功能所需的柔性；
• 也正是因為這種動態的、依靠弱作用力維持的結構特性，它對外界環境的各類變化都非常敏感，溫度的高低波動、環境酸堿度的偏移、體系中鹽離子濃度的改變、容器與溶液的界面作用、加工過程中的剪切力、反復凍融的處理，都很容易破壞它原本的結構。
蛋白質在從生物原料中完成分離純化、得到具備活性的成品后，往往需要儲存數周到數年不等的時間，而要在這段漫長的儲存時間里，一直維持它剛純化完成時的原始生物學功能，就必須從各個環節入手，避免各種可能導致蛋白質失去活性的失活過程（inactivation processes）。
對蛋白質樣品而言，“穩定"的概念至少包含三層清晰明確的含義：
第一層是結構穩定：也就是蛋白質要始終維持純化后正確的空間構象，不能發生整體解折疊，也不能形成錯誤的折疊結構（denaturation/misfolding）。
第二層是物理穩定：也就是蛋白質分子不能相互聚集形成大的團聚體，不能從溶液中析出發生沉淀，不能吸附粘附在儲存容器的內壁上，也不能在氣液界面發生過度聚集（aggregation/precipitation/adsorption）。
第三層是化學穩定：也就是蛋白質的共價化學結構不能發生改變，不能被氧化、發生脫酰胺反應、出現構象異構化、肽鏈斷裂，也不能發生其他類型的不可逆化學修飾（oxidation/deamidation/isomerization…）。
這三層穩定并不是平行、互不干擾的并列關系，相互之間存在明確的先后影響邏輯：
• 蛋白質原本正確的空間結構一旦受到外界因素擾動發生改變，通常就會暴露出原本隱藏在分子內部的疏水基團，進而更容易觸發分子間的聚集過程；
• 蛋白質發生的化學修飾會改變分子表面的電荷分布與疏水性質，這些改變又會進一步提升蛋白質分子發生聚集的傾向性；
• 而由物理吸附帶來的樣品損失，比如蛋白質分子全部粘到了儲存管的管壁上，會讓研究人員直觀上“以為蛋白已經失活壞掉了"，但實際上只是可檢測的有效蛋白樣品不見了。
蛋白質之所以如此脆弱，本質根源要追溯到它維持自身結構的“架構材料"與作用機制。它的完整空間結構，是由一堆強度有限的弱相互作用一點點拼接搭建起來的：
• 由疏水效應驅動折疊形成的、包裹在分子內部的疏水內核。
• 維持多肽鏈局部規則構象的氫鍵網絡，這也是蛋白質二級結構形成的核心基礎。
• 維持不同結構區域電荷平衡與空間穩定的靜電相互作用與鹽橋。
• 讓不同肽鏈或不同結構基團緊密貼合的范德華作用，比如部分蛋白質中的二硫鍵，就會為整體結構起到類似“鉚釘"的加固作用。
這些維持蛋白質結構穩定的相互作用，每一個單獨的結合強度都非常低，但無數個弱相互作用組合在一起，就足以支撐蛋白質折疊成特定的三維空間構象，維持發揮正常生理功能所需的活性狀態。而問題恰恰也出在這里：
弱相互作用的穩定性對環境高度敏感，只要環境條件發生一點點改變，原本維持結構穩定的平衡就很容易被打破推倒。梳理目前已知的會引發蛋白質失活的主要觸發因素，我們可以發現其中存在一個非常關鍵的類別：
• 溶液環境條件的改變，例如溶液濃度被稀釋、環境溫度發生大幅波動、溶液pH偏離蛋白質適宜區間。
• 溶液物理狀態的改變，例如對蛋白溶液反復進行凍融操作。
你可以把蛋白質發生失活的過程，想象成三條特征清晰、機理各異的常見原因：
(1) 蛋白質分子本身的高級結構被外部因素擾動破壞 → 原本包埋在分子內部的疏水結構域暴露在水溶液中 → 暴露的疏水區域相互結合最終形成蛋白聚集：
能夠觸發這一路線的因素十分多樣，溫度異常上升、溶液pH偏離蛋白質結構穩定的適宜窗口、體系中存在高濃度強鹽或者化學變性劑、氣液或固液界面產生的界面應力都可能觸發這一過程。
(2) 蛋白質分子上的活性化學位點發生共價修飾改寫 → 蛋白質分子的整體性質發生改變 → 結構穩定性大幅下降，更容易發生聚集或直接失活：
比如氧化反應會直接改變蛋白質分子原有的疏水分布和表面電荷分布；脫酰胺反應或者異構化反應會改變蛋白質分子局部的空間精細結構；還有不少這類化學修飾反應本身，就和體系的pH值、環境溫度高度相關（比如一些硫醇類試劑，在更高pH、更高溫度的環境中半衰期會明顯更短，更容易引發修飾反應）。
(3) 蛋白質分子本身的結構其實沒發生“損壞"變質，但你再也無法從體系中回收得到完整的目標蛋白：
低濃度條件下的蛋白質會強烈吸附到容器管壁（玻璃材質或塑料材質）以及過濾分離用的介質表面，最終造成有效蛋白的大量損失。我們都知道蛋白在低濃度條件下（例如濃度<50 μg/mL時）往往更不穩定，其中一個十分重要的原因就是這種吸附損失的影響會變得格外顯著。
這三條失活路線，在蛋白質應用的不同場景里，影響的權重并不相同，需要結合具體條件分析判斷。
蛋白質在完成純化操作、正式開展實驗之前的存放等待階段，可能會面臨多種常見的失活風險，具體可以分為以下幾類：
(1) 溫度波動：包括短時間在室溫環境下敞放暴露、實驗過程中反復將蛋白樣品從冰箱中取出又放回導致的溫度反復變化。
(2) pH漂移：包括配制緩沖液時緩沖容量設計不足、緩沖液開放放置過程中吸收空氣中的二氧化碳、凍融過程改變體系離子平衡引發強度變化，比如常用的TRIS緩沖液，不同溫度下pH值會有較大變化，可能在常溫下是合適的pH值，但是在低溫條件下其實蛋白正處于pH不合適的煎熬中。
(3) 凍融損傷：包括冷凍過程中冰晶生長產生的排擠效應、水分結晶析出后導致溶質濃度異常升高、凍融過程中形成新的氣液界面帶來的剪切作用。
(4) 微生物污染：通?？梢酝ㄟ^添加疊氮鈉等試劑抑制微生物生長，但這類抑菌試劑本身帶有毒性，也可以通過0.22 μm濾膜過濾的方式實現樣品無菌化處理。
蛋白質儲存的穩定性本身是一項涉及多環節的體系工程——最終的儲存效果既和目標蛋白質自身的分子結構、理化性質有關，也和儲存所用的容器材質、實驗操作的流程規范、樣品運輸的溫控方式等外部因素密切相關。
在你還沒開始嘗試那些設計復雜、變量繁多的高級篩選實驗之前，建議你先沉下心來做好三件投入少、見效明確，稱得上是“穩賺不賠"的基礎準備工作：
第一件事，明確蛋白質儲存效果的合格判定目標窗口。
• 從功能保留維度看，你需要提前鎖定需要檢測的核心指標：包括蛋白質的生物學活性、分子結合能力，以及三級/四級等關鍵結構指標；
• 從物理穩定性維度看，你需要提前明確需要監控的物理指標：比如蛋白質樣品是否產生可溶性聚集、是否存在肉眼可見的不溶顆粒、溶液整體是否產生渾濁；
• 從化學穩定性維度看，你需要提前圈定需要追蹤的化學指標：比如蛋白質分子特定位點是否發生氧化、脫酰胺這類影響結構與功能的修飾反應。
第二件事，提前固定好影響儲存效果的“環境三要素"。
• 第一個核心要素是儲存溫度，你需要提前確認并鎖定實驗需要的儲存條件，到底是-80℃深凍、-20℃凍存、2–8℃冷藏還是室溫儲存；
• 第二個核心要素是儲存體系的pH與緩沖體系，你需要提前明確實驗采用的緩沖液種類、pH參數并保持全程一致；
• 第三個核心要素是待儲存蛋白質的濃度，你需要提前確認實驗統一的蛋白上樣濃度并固定該參數。
第三件事，專門為“低濃度蛋白質儲存場景"提前預裝好安全防護帶。
• 你需要在實驗設計的早期階段，就把“最終回收率、容器吸附損失"當成評價儲存效果的核心KPI指標；
• 優先開展一輪快速評估，測試低劑量非離子型表面活性劑（如常用的Tween 20）在減少吸附損失上能帶來的實際收益，以及它可能對蛋白質功能、后續實驗產生的潛在副作用。
梳理清楚這些基礎信息，你才能清晰回答最核心的問題：你到底是在什么溫度、什么pH、什么濃度、什么容器里保存哪一種目標蛋白。
FIDA 搭載了8個維度的質量表征參數，可以從蛋白的粒徑，PDI，粘度，黏附性，分子分布，熒光效率等維度全方面評估蛋白樣品的性質，簡單實驗，即可完成上述所說的蛋白穩定性的優化，助力我們找到合適的蛋白純化和儲存條件！
* 本文轉載自「FIDA分子互作技術」微信公眾號
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